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    nature重磅!東亞“年輕人”更容易發生新冠重癥

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    傳送器之太長不看版本:《自然》發布:日本科學家發現東亞“年輕人”更容易發生新冠重癥

    傳送器之nature原文版本:https://www.nature.com/articles/s41586-022-05163-5#Sec4

    摘要

    在宿主遺傳學中,識別當下重癥的COVID-19的潛在因素是一個新的問題1-5。我們進行了一項全基因組關聯研究(GWAS),涉及了在新冠疫情大流行的初期中收集的2,393個日本COVID-19病例和3,289個對照對象,發現了在DOCK2基因附近的 5q35 (rs60200309-A)上發生的一個變異,與“年輕患者(<65歲)”患重癥COVID-19的原因有關。(nCase=440,讓步比=2.01,P=1.2×10-8)。

    這種風險等位基因在東亞人中普遍存在,但在歐洲人中罕見,顯示出了非歐洲人的GWAS(全基因組關聯研究)的價值。對473個大體積外周血的RNA-seq檢測發現,風險等位基因對年輕患者的DOCK2基因表達有遞減作用。DOCK2的表達在重癥COVID-19形式中被抑制。單細胞RNA-seq分析(n=61)確定了DOCK2的細胞類型特異性下調和COVID-19風險等位基因對非經典單核細胞中DOCK2的特異性遞減效應。重癥COVID-19肺炎的肺部標本的免疫組化顯示出DOCK2受到了抑制。此外,在敘利亞倉鼠SARS-CoV-2感染模型中,使用CPYPP抑制DOCK2功能會誘發更嚴重的肺炎,其特征是體重減輕、肺部水腫、病毒量增加、巨噬細胞募集受損和I型干擾素反應失調。DOCK2在宿主對SARS-CoV-2感染的免疫反應和重癥COVID-19的發展中起著關鍵作用,可以作為一個潛在的生物標志物和/或治療目標進一步探索。

    簡介

    由嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)引發的COVID-19是一個嚴重的全球公共衛生問題。盡管最近出現了有發展希望的疫苗,但SARS-CoV-2變種的出現可能會推遲這個大流行病的結束。COVID-19的臨床表現多種多樣,從無癥狀感染到致命的呼吸道/多器官衰竭,與多種風險因素有關。

    人類的遺傳背景影響著人們對傳染病的易感性或嚴重性,也可能對二者均產生了影響。Severe Covid-19全基因組關聯研究(GWAS)小組報告了3p21上的LZTFL1變異與歐洲人患重癥COVID-19的風險有關。令人感興趣的是,這些變異顯示出全球異質性的等位基因頻率譜,并且這些變異在東亞人中很少出現。

    進一步的所做的GWAS工作,包括COVID-19人類基因組計劃(HGI),已經指定了宿主易感基因。然而,現有的研究絕大部分是在歐洲人群中進行的??紤]到COVID-19嚴重程度的全球多樣性,對非歐洲人的COVID-19宿主遺傳分析也應提供新的見解。

    日本COVID-19特別工作組(JCTF)成立于2020年初,是一個全國性范圍的多中心聯盟,來克服日本的COVID-19大流行(擴展數據圖1,補充表1)。在此,我們報告了日本人COVID-19的大規模GWAS結果,并與歐洲人進行了系統的比較,確定了DOCK2區域的特定人群風險等位基因賦予了患重癥COVID-19的風險,特別是在年輕病例中。

    我們進一步對COVID-19患者進行了大量的和單細胞的轉錄組學、免疫組織化學檢測,并在模型生物體內進行體內擾動。我們的研究發現,在敘利亞倉鼠的SARS-CoV-2感染模型中,DOCK2的抑制與重癥COVID-19的發展有關,而且DOCK2介導的信號傳導在宿主對SARS-CoV-2感染的免疫反應中起著關鍵作用。



    結果

    研究參與人員概述

    在本次的重癥新型冠狀肺炎病毒的全基因組關聯研究( TheSevere Covid-19 genome-wide association study(GWAS))中,我們從參加日本新冠肺炎特別工作小組(TheJapan COVID-19 Task Force (JCTF))的100多家醫院中,招募了互不相關的2,393名感染新冠病毒的患者。他們是2020年4月到2021年1月(日本的第1次至第3次新冠大流行)中的住院病例。所有病例的新冠確診均由各附屬醫院的醫生根據臨床表現和陽性的PCR檢測結果來確認。同時,我們在新冠疫情大流行之前招募了互不相關的3,289名被試作為對照組,由他們來代表常規的日本人口。通過主成分分析法,所有參與者都被確認為東亞血統(詳細數據見圖2a,b)。


    在2,393個新冠病例中,有990個病例最終表現出感染新冠的嚴重癥狀。我們把出現嚴重癥狀的標準定義為病人需要供氧支持、人工呼吸和/或住重癥監護室。據此,有1,391個病例表現為新冠感染的輕癥。其余12個病例的嚴重程度信息不明。

    正如上述報告,與輕癥病例(分別為49.3±19.2歲和57.2%的男性)相比,新冠重癥患者的年齡相對較大(65.3±13.9歲[平均值±SD]),且男性比例較高(73.9%)。

    為了進行基因復制研究,我們還從2021年2月至2021年9月(日本第四次至第五次新冠大流行)中招募了1,243新冠重癥病例和3,769名對照組。

    日本人口中的新型冠狀病毒的全基因組關聯研究(GWAS)

    包含所有COVID-19病例的全基因組關聯研究(GWAS)沒有產生滿足全基因組的顯著閾值的信號(P<5.0×10-8;詳細數據見圖2c)。


    跨人群比較證實了以前研究中發現的多個COVID-19相關變異的風險。

    在我們的日本的研究參與者中,11個顯示與新冠陽性有關聯的基因座中有7個被復制,P<0.05,包括LZTFL1、FOXP4、TMEM65、ABO、TAC4、DPP9和IFNAR2等。(圖1a

    在上述七個基因座中,有六個基因座在與重癥年輕的COVID-19病例a的比較中觀察到最高的ORs。在FOXP4上觀察到了最顯著的復制,正如預期的那樣,該基因座在東亞人中的等位基因頻率高于歐洲人(OR=1.29,95%置信區間[95%CI]=1.13-1.46,P=9.1×10-5的嚴重COVID-19)。相比之下,在歐洲人中表現出最強關聯的LZTFL1(rs35081325)的風險等位基因,在日本人中是罕見的。盡管其頻率罕見(在對照組中=0.0013),但我們名義上復制了與重癥年輕COVID-19病例中最高風險的關聯(OR=11.8,95%CI=1.64-85.5,P=0.014)。


    我們通過硅HLA變異歸因分析評估了HLA變異對COVID-19風險的影響。我們沒有觀察到符合HLA范圍內意義閾值的關聯信號(P<0.05/2,482個變異=2.0×10-5;詳細數據見圖3)。在四大ABO血型中,O型血與保護作用有關(P<0.05),在重癥和年輕的病例中最為明顯(OR=0.73,95%CI=0.56-0.93,P=0.014;詳見數據圖4a)1。我們發現AB血型的患病風險增加,特別是在重癥病例中(OR=1.41,95%CI=1.10-1.81,所有年齡段的P=0.0065)。日本人是擁有AB型血頻率最高的人群(在我們的研究中=9.5%),這可能提供了預測風險的能力。


    跨種群的孟德爾隨機化

    接下來,為了闡明能夠影響COVID-19易感性的醫療條件,我們在日本人群中應用了跨人群的雙樣本孟德爾隨機化(MR)分析。 重癥COVID-19被推斷出與肥胖存在因果效應 (P<0.0074;擴展數據圖4b)。我們觀察到哮喘、尿酸(UA)和痛風存在的因果推斷,而系統性紅斑狼瘡(SLE)則顯示出保護作用(P<0.05)。在日本,高尿酸血癥是重癥COVID-19的風險因素,這與我們的MR發現一致。在歐洲人中,我們觀察到肥胖的顯著因果推論(P<6.2×10-6),與自我報告的COVID-19相比,住院和重癥COVID-19的效應大小翻倍。我們的分析提供了肥胖作為風險因素的額外證據。


    DOCK2的特定人群風險等位基因

    根據觀察,許多COVID-19風險變異在重癥和年輕病例中賦予更大的影響,我們接下來根據患者的年齡和嚴重程度對受試者進行分層分析,其中重癥COVID-19病例(nCase=990),年輕病例(年齡<65,nCase=1,484),以及它們的組合(nCase=440)被進行分析。

    當比較年輕的重癥COVID-19病例與各自的對照組相比,我們在5q35上發現了一個滿足全基因組意義的基因座(rs60200309的P=1.2×10-8;圖1b)。位于DOCK2下游基因間區域的主導SNP(rs60200309)的A等位基因與嚴重COVID-19感染的風險膨脹有關(OR=2.01,95%CI=1.58-2.55,P=1.2×10-8;圖1c)。在包括所有COVID-19病例和對照組的其他比較中,風險rs60200309-A等位基因也與COVID-19的風險升高有關(OR=1.24,也表現為病例內嚴重程度分析(即重癥與非重癥病例;所有年齡的OR=1.27,年齡<65的OR=1.90)。


    然后,我們利用在日本的后幾波大流行中另外收集的1243個重癥病例和3,769個對照組進行了復制研究。 我們在年輕病例中復制了一個特定年齡的名義風險(nCase=833;OR=1.28,95%CI=1.02-1.61,P=0.033)與所有年齡段(OR=1.00,95%CI=0.85-1.19,P=0.96)相比,而效果規格小于在最初大流行波中收集的GWAS病例中觀察到的。我們注意到,在后面的大流行浪潮中,普遍觀察到其他風險位點的嚴重性風險下降(例如,LZTFL1的OR從11.8降至4.4;回歸系數=0.57;擴展數據圖5)。這可能表明,伴隨著大流行浪潮的混雜因素的縱向轉移,如治療策略的引入、疫苗接種的高普及率、住院政策的變化和病毒株的演變,可能減輕了最初大流行浪潮中定義的宿主遺傳學負擔,而進一步的評估將是有必要的。


    我們還研究了不同血統的DOCK2變異的COVID-19風險(3,138醫院病例與來自泛血統薈萃分析產生的891,375對照組)我們注意到具有邊緣關聯信號的相同方向效應。該變異在東亞人中很普遍(=0.097),在日本人中頻率最高(=0.125),在美國本地人中頻率較低(=0.049),但在其他血統中非常罕見。(<0.005;圖1d)。在日本人22中進行的自然選擇篩查表明該變異的邊際正選(PSDS=0.051)。DOCK2變異的人群特異性特征為在非歐洲人中進行COVID-19宿主遺傳學研究提供了依據。


    DOCK2在重癥COVID-19病例中抑制

    為了對DOCK2風險變異進行功能注釋,我們通過對JTCF(n=473)收集的covid-19患者進行外周血RNA-seq檢測來檢測eQTL效應。DOCK2的風險等位基因(rs60200309-A)對所有患者都沒有顯示出明顯的eQTL效應(β=- 1.07,P=0.083;圖2a)。當按年齡分層時,在年輕患者中觀察到了風險等位基因對DOCK2顯現水平的負面影響(n=270;β=-2.15,P=0.0030,年齡<65)。該等位基因在其他周圍的基因上沒有顯示任何明顯的eQTL(±500kb窗口,P>0.070)。我們也觀察到了GWAS和DOCK2 eQTL信號之間的同位性(同位性后驗概率>0.01;擴展數據圖6)。


    我們在重癥和536例非重癥covid-19患者之間,進行了對DOCK2的基于實時qpcr的DE分析 (n=468)。我們發現在重癥患者中DOCK2的表達減少 (=DOCK2/GAPDH)(P=0.011;圖2b)。當分組為年輕患者時,對DOCK2的抑制更為明顯(P=0.0068)。當患者進一步分組為無癥狀、輕度、重癥和危重病例時,我們觀察到DOCK2的表達水平與嚴重程度等級之間呈負相關(圖2c)。同時,DOCK2表達在重癥COVID-19患者的外周血細胞中抑制,特別是在年輕患者中,風險變異可能通過抑制DOCK2的表達導致重癥COVID-19。


    DOCK2(dedicator of cytokinesis 2)是一種Rac激活劑,參與趨化因子信號、I型干擾素(IFN)產生和淋巴細胞遷移。要弄清DOCK2在COVID-19生物學中的作用,就必須弄清免疫細胞類型的特定表達譜。因此,我們對來自30個COVID-19重癥病例和31個健康對照的外周血單核細胞(PBMC)進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)。我們獲得了394,526個高質量的單細胞,并注釋了12個集群(圖2d擴展數據圖7)。投射時,DOCK2在CD16+單核細胞中的表達最高(圖2e)。先天性免疫細胞群(單核細胞和樹突狀細胞[DC])中表達DOCK2的細胞比例(43.8%)高于其他細胞群(25.6%;圖2f)。DE分析也表明,在COVID-19重癥病例中,免疫細胞群中的DOCK2表達也受到抑制(單核細胞的FC=0.82,P=8.3×10-4;DC的FC=0.87,P=0.050;圖2g)。



    為了分解免疫細胞類型的特異性,我們重新進行了聚類和注釋,提取了63,544個屬于先天性細胞群的細胞(圖2h擴展數據圖7)。在分類的細胞類型中(經典[CD16+CD14++],中間體[CD16+CD14+],和非經典[CD16++CD14+]單型,傳統樹突狀 和漿細胞樣樹突狀細胞),DOCK2的表達明顯較高,這些單核細胞涉入了COVID-19的病理生理學(圖2h-j)。DE分析顯示DOCK2在非經典單核細胞中的抑制作用最強(FC=0.61,P=3.2×10-7;圖2k)。 Covid-19病例的非經典單核細胞中DOCK2共表達基因模塊涉及到豐富的途徑,如免疫反應信號途徑和吞噬作用(擴展數據圖7)。為了鞏固變異功能的證據,我們評估了DOCK2風險變異的單細胞eQTL效應。我們發現COVID-19風險變異對DOCK2在非經典單核細胞中的表達有特定的劑量遞減效應(COVID-19的β=-0.21,P=0.035;對照組的β=0.02,P=0.51;圖2l)。


    然后我們評估了DOCK2抑制的生物學影響。在原生細胞實驗中,通過CPYPP(一種DOCK2-Rac1相互作用的抑制劑29)對DOCK2的抑制表明,在CpG刺激下,pDC產生的IFN-α減少(FC=5.5×10-5,P=0.0038,每組n=3;擴展數據圖8a)。 pDC是參與COVID-19致病性30的另一個關鍵先天免疫細胞,在COVID-19病例中DOCK2的表達抑制(FC=0.79,P=0.019;圖2k)。在CXCL12刺激下,CD3+T細胞的趨化作用被阻斷(FC=0.57,P=1.0×10-7,每組n=19;擴展數據圖8b)。DOCK2風險變異與pDC中IFN-α產生和CD3+T細胞趨化的表型聯系不顯著。在THP-1藍色ISG細胞中,DOCK2顯示了ISG的轉錄激活明顯減少,這是I型IFN的替代物(擴展數據圖8c-f)。這些結果突出了DOCK2在COVID-19惡化中的重要免疫作用,如I型IFN免疫和趨化性失調,例如I型IFN免疫先天性受損的患者。


    為了證實DOCK2參與到了COVID-19肺炎,我們用COVID-19的人類尸體解剖進行了免疫組織化學分析。 (擴展數據圖9)。我們檢查了3例COVID-19肺炎病例,觀察到DOCK2在肺部和肝臟淋巴結的淋巴細胞和巨噬細胞中的表達減少(樣本1-3;圖2m)。在兩個沒有肺炎的對照樣本中,我們沒有觀察到這種減少(樣本4,5;圖2n)。據報道,DOCK2在COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞中受到抑制,這與我們的發現一致。我們觀察到非COVID-19重癥肺炎病例(樣本6)的淋巴細胞中DOCK2的表達消失,而非COVID-19輕癥肺炎病例(樣本7)中DOCK2的表達略有下降。因此,在COVID-19引起的重癥肺炎期間,DOCK2的表達會被抑制。這些觀察揭示了DOCK2的細胞類型和組織特異性抑制之間的聯系,提供了作為嚴重COVID-19的生物標志物的潛在價值。


    敘利亞倉鼠模型中的DOCK2抑制作用

    為了搞清楚DOCK2在COVID-19中的體內發病機制,我們用敘利亞倉鼠模型調查了感染SARS-CoV-2后DOCK2抑制的效果(擴展數據圖10a)。對模擬感染的動物施用CPYPP(DOCK2抑制劑)或Vehicle(陰性對照)并沒有誘發體重下降(擴展數據圖10b)。當使用Vehicle時,感染SARS-CoV-2的動物(n=12)在dpi7時體重下降到83.3%,然后,體重在dpi11時恢復到97.6%。相反,當使用CPYPP時,感染SARS-CoV-2的動物(n=13)在dpi7時體重出現異常下降到79.0%,然后在dpi11時體重恢復僅到85.4%(圖3a擴展數據圖10c)。我們在施用CPYPP后的模擬感染動物肺部,觀察到高級肺水腫(dpi 11;圖3b)。在dpi6時觀察到最大的肺部重量(圖3c)和最大的肺組織病理學評分變化(圖3d擴展數據圖10d-f)。在肺部免疫組織化學中,在施用CPYPP的模擬感染動物的體內,CD68巨噬細胞在肺泡細胞周圍的遷移受到了影響(圖3d擴展數據圖10e)。



    另一方面,在施用CPYPP的感染動物或施用CPYPP的未感染動物中,肺部損害是輕微的或根本沒有(圖3b-d擴展數據圖10d-f)。

    針對SARS-CoV-2誘導的肺炎的惡化階段(dpi 3和6),我們檢測了不同器官中的SARS-CoV-2病毒載量。在施用CPYPP的動物的鼻拭子(dpi 3和6)、肺(dpi 3)和腸(dpi 6,P<0.05;圖3e)中,病毒載量有所增多。肺細胞因子表達譜檢測顯示,在施用CPYPP的情況下,I型IFN(IFN-α/β)在dpi6時減少,II型IFN(IFN-γ)在dpi3時增加(圖3f)。我們還觀察到,施用CPYPP誘發了炎癥細胞因子(dpi3時為IL-6)和趨化因子(dpi3時為CCL5)水平的升高。IFN反應對COVID-19的致病性所起到的作用一直存在爭議31,35,36。通過對DOCK2抑制的觀察和干預,我們發現了COVID-19肺炎的病理生理學,即感染部位的巨噬細胞募集能力減弱和IFN反應失調導致的病毒消除能力受損,肺部炎癥延長。


    在這篇論文中,我們采用全基因組關聯的分析方法(GWAS),分析了COVID-19在日本的情況,這也是最早針對非歐洲國家進行的大規模COVID-19宿主遺傳學研究之一。我們的研究不但證實了在不同人群中,多種遺傳變異都與感染COVID-19的風險有關。而且還發現了DOCK2上有針對某種特定人群的風險變異,這一點,在最初大范圍感染的年輕重癥病例身上尤為明顯。

    跨人群MR分析揭示出一種因果推理,那就是在COVID-19上看到了許多復雜的人類特質,比如肥胖。我們的結果突出了針對特定人群的風險等位基因宿主遺傳背景的作用,強調了在非歐洲地區,進行COVID-19宿主遺傳學研究的必要性。值得關注的是,常染色體隱性基因DOCK2的缺乏是一種孟德爾病,伴有免疫缺陷和嚴重的侵襲性肺炎感染(OMIM:#616433)。

    實驗結果應該證實了孟德爾病和常見疾病之間的遺傳和臨床聯系。我們又從后續幾波大流行病人中收集數據,進行了重復實驗,觀察到包括DOCK2和LZTFL1在內的風險變異,對COVID-19重癥產生的影響雖然相對小了一些,但還是很明顯,這與針對最初大流行病人開展的實驗,結果一致。

    但是,宿主遺傳是如何與這些復雜因素互動的,進而通過大流行疾病來影響COVID-19的表型譜,仍然是未知的。在不久的將來,應該授權更多的大規模COVID-19宿主遺傳學研究,要涉及不同的血液收集地點和階段,這有助于指導全球健康戰略,防止大流行病的發生。

    通過GWAS的后續分析,我們表明DOCK2介導的信號對SARS-CoV-2感染的反應中起著關鍵作用,說明異形的DOCK2等位基因參與了COVID-19的惡化,所以,DOCK2或許可以作為預測重癥COVID-19的臨床生物標志物。

    對外圍血細胞的大量和單細胞轉錄組分析發現,在重癥的COVID-19患者中,DOCK2風險變異抑制了COVID-19特異性eQTL效應,這在先天免疫細胞包括非經典單核細胞和pDC中最明顯,但這一結論可能是互為因果的循環論證。

    未來,在感染初期,風險變異可能會誘導DOCK2的下降。免疫組織化學分析顯示,在感染了COVID-19肺炎的肺部,DOCK2是受到抑制的。在敘利亞倉鼠模型中,SARS-CoV-2感染后,CPYPP對DOCK2的體內抑制導致了重癥COVID-19肺炎,突出表現為巨噬細胞的遷移受損和IFN反應失調。

    我們注意到有一種可能性是CPYPP并非對DOCK2有特異性,而是抑制其他的DOCK家族基因?;蛘?,需要對DOCK2進行加強實驗,理想情況下,就能為DOCK2在COVID-19中的病理生理學作用提供證據。如果結合其在免疫調節中的關鍵作用,DOCK2的上調可能被看作是COVID-19的治療策略。我們的結果促使未來更多的研究,那就是把DOCK2與COVID-19分子和臨床表型聯系起來幫助我們克服這一大流行病的挑戰。

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